紡錘体チェックポイント

細胞分裂の3つのタイプ。二分裂（binary fission、原核生物で起こる）、有糸分裂と減数分裂（真核生物で起こる）。

細胞のサイズが十分に大きくなり、または適切な刺激を受けて細胞が分裂の準備が整った際には[20]、細胞は細胞周期の進行を開始する機構を活性化する。S期には中心体を含む大部分の細胞小器官の複製が行われる。そのため、細胞分裂過程が終結したときには、各娘細胞は完全な細胞小器官のセットを受け取ることとなる。それと同時に、S期にはDNAの複製が非常に正確に行われる必要がある。DNA複製が完了すると、真核生物ではDNA分子は凝縮され、分裂期染色体が形成される。各分裂期染色体は2つの姉妹染色分体から構成され、姉妹染色分体間の接着が確立されている。各染色分体は完全なDNA分子であり、細胞の2つの極にそれぞれ1つずつ位置する中心体のいずれかと微小管を介して接着される。中心体と微小管によって形成されるこの構造はその形状から紡錘体と呼ばれており、染色体は2つの中心体の間に保持される。姉妹染色分体間の接着は後期に切り離され、各染色分体は微小管を介して接着している中心体へ向かって移動する。このようにして、細胞分裂過程の終結時に娘細胞が切り離された際には、それぞれが完全な染色分体のセットを受け取る。細胞分裂時の姉妹染色分体の正確な分配を担う機構は染色体分離（chromosome segregation）と呼ばれている。

染色体分離が正しく行われることを保証するため、細胞は正確で複雑な機構を発達させている。まず、細胞はDNA複製と中心体の複製を協調的に行う必要があり、この過程に欠陥が生じると極が1つしかない、または多数の極を持つ紡錘体が形成される。こうした場合には染色体の分配のバランスが取れないため、異常な染色体分離が行われる[21]。

有糸分裂中のヒト細胞の画像。緑色で示された微小管は紡錘体を形成しており、青色で示された染色体は紡錘体の赤道面に位置している。キネトコアは赤色で示されている。

S期の間に中心体は複製を行う。有糸分裂の開始時点で、双方の中心小体の長さは最大となり、さらなる物質をリクルートして微小管核形成能力を増大させる。有糸分裂が進行すると、双方の中心体は分離して紡錘体を形成する[22]。こうして紡錘体は微小管が発する2つの極を持つこととなる。微小管はタンパク質性の長い繊維で、非対称的な末端を持つ。一方の末端は(−)端と呼ばれ、比較的安定で中心体に近接している。もう一方の末端は(+)端と呼ばれ、伸長と短縮を繰り返しながら細胞の中心部で染色体を探索する。各染色分体にはセントロメアと呼ばれる特別な領域が存在し、その上にはキネトコアと呼ばれるタンパク質性の構造が組み立てられてられる。この構造は微小管の(+)を安定化することができる。そのため、細胞の中心部を探索している微小管が偶然にキネトコアと遭遇すると、キネトコアは微小管を捕捉し、染色体は姉妹染色分体の一方のキネトコアを介して紡錘体へ接着することとなる。染色体はキネトコアの紡錘体への接着に活発な役割を果たす。クロマチンにはRanのグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）が結合しており、染色体近傍のRanはGDPの代わりにGTPの結合が促進される。活性化されたGTP結合型のRanは細胞質のタンパク質複合体からTPX2などの微小管安定化タンパク質を解離させ、染色体周辺で微小管の核形成と重合を誘導する[23]。こうしたキネトコア由来の微小管は、outer kinetochoreのキネシンモータータンパク質ともに、紡錘体由来の微小管の側面との相互作用を促進する。こうした側面との接着は不安定であり、末端型の接着へと変換される必要がある。側面型の接着から末端型の接着への変換によって、微小管の(+)端の伸長と短縮は、染色体の適切な二方向型（bi-orientation）の接着を達成するために染色体を押したり引いたりする力へと変換される。姉妹染色分体間は接着されており、また双方のキネトコアは双方の染色分体上で背中合わせに位置しているため、一方のキネトコアが1つの中心体に接着されると、もう一方のキネトコアは反対側の極に位置する中心体へ向かって露出するようになる。そのため、ほとんどの場合2つ目のキネトコアは微小管を介して反対側の極の中心体と結合し[24]、染色体は細胞分裂時の適切な分離が保証される基本的な二方向性配置（アンフィテリック（amphitelic）とも呼ばれる）となる[25][26]。時折、2つの姉妹キネトコアの1つが双方の極から発した微小管に同時に接着することがある。この配置はメロテリック（meroteric）と呼ばれ、紡錘体チェックポイントによっては検知されず、後期の間も中心部に取り残された染色体が形成され、異数性が生じる可能性がある。メロテリック型の配置は有糸分裂の初期には頻繁にみられるが、このタイプの配置はオーロラBによって検知されて取り除かれる[27]。オーロラBはさまざまなタイプの腫瘍で過剰発現しており、抗がん剤開発の標的となっている[28]。

上述したように、姉妹染色分体はS期（DNA複製によって2つの同一なコピー（染色分体）が生成される時期）から後期まで結合したままである。後期には、姉妹染色分体は分離され、分裂中の細胞のそれぞれ反対側の極へ向かって移動する。酵母とアフリカツメガエルXenopus laevis卵抽出液での遺伝学的・生化学的研究により、姉妹染色分体間の接着において必要不可欠な役割を果たしている、多数のタンパク質からなる複合体が同定されている[29]。この複合体はコヒーシン複合体として知られており、出芽酵母ではSmc1p、Smc3p、Scc1p（またはMcd1p）、Scc3pという少なくとも4つのサブユニットから構成されている。Smc1pとSmc3pは、高度に保存された染色体関連ATPアーゼのグループである、SMCタンパク質（Structural Maintenance of Chromosomes）と呼ばれるファミリーに属し、ヘテロ二量体（Smc1p/Smc3p）を形成する。Scc1pはRad21の出芽酵母ホモログであり、分裂酵母Schizosaccaromyces pombeでDNA修復に関与するタンパク質として最初に同定された。これら4つのタンパク質は酵母では必須であり、どれか1つにでも変異が生じると姉妹染色分体が早期に分離するようになる。酵母では、コヒーシンは染色体の腕に沿って優先的に結合し、セントロメアに近接して非常に豊富に存在することがクロマチン免疫沈降を用いた研究によって示されている[30]。

古典的な細胞学的観察から姉妹染色分体はヘテロクロマチン領域でより強固に接着していることが示唆されており[31]、ヘテロクロマチンの特別な構造または組成がコヒーシンのリクルートに有利に働いている可能性が示唆されている[32]。事実、分裂酵母ではSwi6（HP1の分裂酵母ホモログ）はヒストンH3のメチル化されたリジン9番残基に結合し、コヒーシンのセントロメアリピートへの結合を促進する[33][34]。より近年の研究からは、分裂酵母と脊椎動物の双方において、RNAi装置がヘテロクロマチンの確立を調節しており、この領域へのコヒーシンのリクルートを調節していることが示唆されている[35][36]。一方で、出芽酵母ではセントロメアに近接したヘテロクロマチン領域が存在しないにもかかわらず、機能的なセントロメアの存在によってそれに隣接する20–50 kbの領域でコヒーシンの結合の増加が誘導されることから、ヘテロクロマチン以外にもセントロメアでの接着の強化を保証する機構が存在するはずである[37]。

これに関連して、ヒト細胞では有糸分裂中にOrc2（S期のDNA複製の開始に関与する複製起点認識複合体（ORC）に含まれるタンパク質の1つ）もキネトコアに局在している[38]。一部の観察では酵母のOrc2は姉妹染色分体間の接着に関与することが示唆されており、その除去によってSACの活性化が誘導される[39]。また、ORC複合体の他の構成要素（分裂酵母のOrc5など）も接着に関与することが観察されている[40]。ORCタンパク質が関与する経路はコヒーシン経路に対して相加的に作用するようであるが、その大部分は未解明である。

姉妹染色分体間の接着とキネトコアを介した紡錘体微小管への固定の模式図

セントロメアでの接着は紡錘体微小管による極方向への力に抵抗し、姉妹キネトコア間に張力を発生させる。この張力は、オーロラBが関与すると考えられている機構によって、微小管-キネトコア間の接着を安定化する[41]。

事実、細胞内のコヒーシンレベルの低下は、姉妹染色分体の早期分離を引き起こすとともに、染色体の中期板への集合の欠陥や、オーロラBを含む染色体パッセンジャー複合体（chromosomal passenger complex）タンパク質の脱局在を引き起こす[42][43]。提唱されているコヒーシン複合体の構造からは、この複合体が双方の姉妹染色分体を直接的に連結していることが示唆されている[44]。この提唱構造では、コヒーシン複合体のSMC構成要素は構造的な役割を果たしているとされ、SMCヘテロ二量体はDNA結合タンパク質として機能し、そのコンフォメーションはATPによって調節されている可能性がある[45]。しかしながら、Scc1pとScc3pが調節的な役割を果たしている可能性もある[29]。

出芽酵母では、Pds1p（セキュリンとしても知られる）が姉妹染色分体間の接着を調節している。Pds1pはプロテアーゼEsp1p（セパラーゼまたはセパリン）に結合し、阻害を行う。後期の進行が開始されると、後期促進複合体（APC、APC/Cまたはサイクロソーム）がセキュリンを分解する。APC/CはRING型E3ユビキチンリガーゼであり、ユビキチンが付加されたE2ユビキチン結合酵素をリクルートする。セキュリンは、APC/Cの活性化サブユニットであるCdc20がAPC/Cのコアに結合している場合にのみ、APC/Cに認識される。セキュリン、Cdc20、E2酵素がすべてAPC/Cに結合すると、E2酵素はセキュリンをユビキチン化し、セキュリンは選択的に分解される。セキュリンの分解によってセパラーゼが放出され、セパラーゼは2つの姉妹染色分体を連結しているコヒーシンのリングを分解し、姉妹染色分体の分離が促進される[46]。Polo/Cdc5キナーゼがScc1の切断部位に隣接するセリン残基をリン酸化し、このリン酸化が切断活性を促進することも示されている[47]。

この装置は進化の過程を通じて保存されているが[48][49]、脊椎動物では大部分のコヒーシン分子はAPC/Cの存在とは無関係に前期に放出される。この過程はポロ様キナーゼPLK1とオーロラBに依存している[50]。しかし、ヒト細胞では少量のScc1は中期までセントロメアに結合したままであり、同程度の量が後期に切断されてセントロメアから消失する[51]。一方で一部の実験からは、姉妹染色分体の腕部の接着は姉妹セントロメアの分離後に徐々に失われることで、姉妹染色分体が細胞の反対側の極へ向かって移動することも示されている[52][53]。

染色体の腕部のコヒーシンの一部とセントロメアのコヒーシンはタンパク質シュゴシン（Sgo1）によって保護されることで、前期での放出を回避している[54][55]。Sgo1がセントロメアの接着の保護因子として機能するためには、Pds1と同様に後期の初めに不活性化される必要がある。事実、脊椎動物ではPds1とSgo1はどちらもAPC/Cの基質である[56]。

SACは不適切に連結されたキネトコアと紡錘体微小管の間の相互作用を監視しており、キネトコアが紡錘体へ正しく接着されるまで維持される。前中期の間、Cdc20とSACタンパク質は紡錘体への接着の前にキネトコアへ濃縮される。これらのタンパク質は、除去されて正しいキネトコア-微小管間接着がなされるまで、SACの活性化状態を維持する。1つでも未接着のキネトコアが存在すると、SACは維持される[57]。微小管の(+)端の接着とキネトコア微小管の形成後、Mad1とMad2はキネトコアから除去される。チェックポイントの活性化の他の調節因子は、キネトコアの張力である。姉妹キネトコアがそれぞれ反対側の極に正しく接着しているときには、紡錘体の力によってキネトコアに張力が発生する。二方向型の接着がなされたキネトコアでの強い張力はキネトコアと微小管の組み立てを安定化するが、弱い張力は不安定化する作用がある。双方のキネトコアが一方の極に接着されるシンテリック（syntelic）型などの不適切な接着では、発生する張力の弱さによって不適切な接着は不安定化され、キネトコアが紡錘体へ正しい形で再接着を行うことが可能となる。染色体パッセンジャー複合体のオーロラB/Ipl1キナーゼが不適切なキネトコア接着の張力センサーとして機能し、微小管-キネトコア相互作用面に位置する、微小管切断KinI型キネシンMCAK、DASH複合体、Ndc80/Hec1複合体の制御を通じて不適切な接着を不安定化する[58][59]。オーロラB/Ipl1キナーゼは、1つのキネトコアが双方の極に同時に接着されているメロテリック（merotelic）型接着の修正にも重要である。メロテリック型接着は十分な張力を発生するため、SACによって検出されない。修正されない場合、染色分体のゆっくりとした移動速度のために染色体の誤分離が生じる可能性がある。

SACが活性化されると、MCCの活性の調節を介したAPCの阻害により、後期への移行は防がれる。MCCによるAPCの阻害機構はあまり解明されていないが、MCCはBubR1（Mad3）のKEN-boxモチーフを用いて偽基質としてAPCに結合すると考えられている。MCCの活性化と同時に、セントロメアタンパク質のCENP-EもBubR1を活性化し、後期の進行を防ぐ[58]。

MCCはBub3と、Cdc20に結合したMad2、Mad3（BubR1）から構成される。Mad2とMad3はCdc20上の異なる部位に結合し、相乗的作用によってAPC/Cを阻害する。Bub3は、Mad3やBubR1のGLEBSモチーフと呼ばれるshort linear motifを介して結合を行う。MCCの形成のための結合の正確な順序はいまだ不明であるが、Mad2とCdc20が複合体を形成すると同時にBubR1、Bub3とCdc20も他の複合体を形成し、続いてこれら2つのサブ複合体が合体することでMCCが形成されている可能性がある[57]。ヒト細胞では、BubR1のCdc20への結合に先立ってMad2がCdc20に結合している必要があり、そのためMad-Cdc20サブ複合体がMCC形成の開始因子として機能している可能性がある。BubR1を欠失してもMad2-Cdc20のレベルはわずかに低下するのみである一方で、Mad2はBubR1-Bub3がCdc20に結合するために必要である。しかしながら、BubR1はチェックポイントの活性化には必要である[58]。

MCCの形成機構は明らかでなく、キネトコア依存的な形成と非依存的形成という競合する仮説が存在する。キネトコア非依存的形成を支持する証拠としては、キネトコアの組み立ての核となるタンパク質が変異した細胞やSACが不活性化された細胞でもMCCが検出されることが挙げられる。このことはMCCはキネトコアへの局在がなくとも有糸分裂期に組み立てられることを示唆している。あるモデルでは、前中期の未接着キネトコアは、機能的なSACを介してAPCをキネトコアへリクルートすることによって、APCのMCCによる阻害に対する感受性を高めているとされる。さらに、Mad2とBubR1の欠失はキネトコア非依存的に有糸分裂のタイミングに影響を与えるが、他のSACタンパク質の欠失は有糸分裂の持続期間に影響を与えることなくSACの機能不全を引き起こすことが明らかにされた。SACは、第一段階ではMad2とBubR1がキネトコア非依存的に有糸分裂の持続期間を制御し、第二段階では他のSACタンパク質と同様に未接着のキネトコアが存在する場合に延長を行うという、二段階のタイマーとして機能している可能性がある[58]。

一方で、現在主力となっているモデルは「Mad2鋳型モデル」であり、これはMCCの形成がMad2のキネトコアでのダイナミクスに依存するモデルである。Mad1は未接着のキネトコアに局在し、Mad2と強く結合する。Mad2とBubR1のキネトコアへの局在は、オーロラBにも依存している可能性がある[60]。オーロラBを持たない細胞は、染色体が微小管と接着していない場合でも中期での停止が起こらない[61]。Mad2には開いたコンフォメーション（O-Mad2）と閉じたコンフォメーション（C-Mad2）が存在する。未接着のキネトコアはまず Mad1/C-Mad2/p31^comet複合体を結合し、未解明の機構によってp31^cometを放出する。残ったMad1/C-Mad2複合体はO-Mad2をキネトコアへリクルートする。O-Mad2はコンフォメーション変化を起こし、C-Mad2となってMad1と結合する。このMad1/C-Mad2複合体はキネトコアへのさらなるO-Mad2のリクルートを担い、O-Mad2はC-Mad2へのコンフォメーション変化を起こしてCdc20に結合するという自己増幅反応が行われる。Mad1とCdc20はどちらも類似したMad2結合モチーフを持っているため、Cdc20への結合時にはC-Mad2へのコンフォメーション変化が起こる。このポジティブフィードバックループはp31^cometによって負に調節されている。p31^cometはMad1やCdc20に結合したC-Mad2に対して競合的に結合し、O-Mad2がC-Mad2へさらに結合していくことを防ぐ。下等真核生物にはp31^cometが存在しないことを考えると、他の制御機構も存在する可能性がある。「鋳型モデル」という名称は、Mad1/C-Mad2がC-Mad2/Cdc20の形成の鋳型として機能することに由来している。こうしたC-Mad2/Cdc20複合体形成によるCdc20の隔離がSACの維持には必要不可欠である[57]。

姉妹染色分体の正しい二方向型接着がなされた後にSACを不活性化する機構はいくつか存在する。微小管-キネトコア間の接着に伴って、ダイニン複合体によるstripping（引きはがし）機構によってSACタンパク質はキネトコアから遠くへ輸送される[58]。引きはがされるタンパク質にはMad1、Mad2、Mps1、CENP-Fが含まれ、その後これらは紡錘体の極に再分布する。Strippingの過程は、未損傷の微小管構造と、微小管に沿ったダイニンの運動性に高度に依存している。p31^cometはC-Mad2のポジティブフィードバックループの調節因子として機能するとともに、SACの不活性化因子としても作用する可能性がある。未接着のキネトコアは一時的にp31^cometを不活性化するが、接着によって（おそらくリン酸化を介して）再活性化されてMad2の活性化を阻害する。他のSAC不活性化機構としては、Cdc20の非分解性ユビキチン化によるMad2-Cdc20複合体のエネルギー依存的な解離によるものがある。逆に、脱ユビキチン化酵素プロテクチンはSACの維持に必要である。未接着のキネトコアは継続的にMad2-Cdc20サブ複合体を再形成することによってチェックポイントを維持している。SACはAPCの活性化によるタンパク質分解によっても不活性化される可能性がある。サイクリンBのタンパク質分解とCDK1/サイクリンBの不活性化もSACの活性を阻害する。後期におけるMps1の分解は、姉妹染色分体間の接着の除去後のSACの再活性化を防ぐ。チェックポイントの不活性化後や細胞周期が正常に後期へ移行した場合、APCはMCCの活性の低下によって活性化される。このとき、酵素複合体は後期阻害因子であるセキュリンをポリユビキチン化する。セキュリンのユビキチン化と分解によって、セパラーゼと呼ばれるプロテアーゼが放出される。セパラーゼは姉妹染色分体を保持している接着分子を切断し、後期を活性化する[23]。

キネトコアでの末端型の微小管接着がSACシグナル伝達の特定の段階を破壊する過程の説明として、新たな機構も提唱されている。未接着のキネトコアでは、MCC形成の第一段階はキナーゼMps1によるSpc105のリン酸化である。その後、リン酸化されたSpc105は下流のシグナル伝達タンパク質である、Bub1、Bub3、Mad1、Mad2、Mad3、Cdc20をリクルートすることができるようになる。未接着キネトコアでのMad1との結合はMad2のコンフォメーション変化を引き起こし、O-Mad2からC-Mad2へ変換される。Mad1に結合したC-Mad2はその後、他のO-Mad2分子と二量体化し、Cdc20周辺でのC-Mad2への変換を触媒する。このC-Mad2/Cdc20複合体は、他のMCCが形成されるようキネトコアにMad1とC-Mad2を残して解離する。MCCはそれぞれ2分子のCdc20を隔離し、APC/Cとの相互作用を防ぐことによってSACを維持している[23]。Mps1によるSpc105のリン酸化はSACシグナル伝達経路の開始に必要かつ十分であるが、この段階はキネトコアへの微小管接着が存在しない場合にのみ起こる。内在性のMps1はNdc80のカルポニン相同ドメイン（CHドメイン）と相互作用することが示されており、Ndc80は染色体から離れたouter kinetochore領域に位置している。Mps1はouter kinetochoreにつながれているが、Ndc80の柔軟なヒンジ領域によってinner kinetochore内に局在しSpc105をリン酸化することができる。新たな提唱機構である機械的スイッチモデルでは、微小管のキネトコアへの末端型結合は2つの機構によってSACを不活性化するとされている。接着された微小管はNdc80のCHドメインとSpc105の間の距離を広げる。さらに、接着された微小管の周囲にリングを形成する、160のタンパク質からなる巨大複合体Dam1/DASH複合体が2つのタンパク質の間の障壁として作用する。この分離によってMps1とSpc105の間の相互作用が妨げられ、SACシグナル伝達経路は阻害される[62]。

このモデルは動物を含むより高等な生物でのSACの調節には当てはまらないことに留意しておくことは重要である。出芽酵母のキネトコア構造には1本の微小管しか接着しないが、動物のキネトコアは多数の微小管の結合部位を含むはるかに複雑な網目構造をしている[63]。そのため、SACの不活性化と後期への移行には、キネトコア結合部位のすべてに微小管が付着していることは必要とされない。すなわち、動物のキネトコアでは、SACが阻害されている間、微小管に接着した状態と接着していない状態が共存している。このモデルには、接着したキネトコアに結合したMps1が隣接する未接着キネトコアのSpc105をリン酸化するのを妨げるような障壁機構が含まれていない。さらに、酵母のDam1/DASH複合体に相当する複合体は動物細胞には見つかっていない。

パクリタキセル（タキソール）の化学構造。がんの化学療法に用いられる有糸分裂阻害剤である。

この研究分野の進展によって、紡錘体形成の欠陥を標的とした治療法の開発が始まっている。ビンカアルカロイドやタキサンなどの古い治療法は紡錘体形成に加わる微小管を標的とし、微小管のダイナミクスを破壊することでSACによって細胞周期を停止させ、最終的に細胞死を引き起こすものである[77]。パクリタキセルとドセタキセルはどちらも現在でも乳がん、卵巣がんや他の上皮性がんの治療に用いられている。しかし、こうした治療法は多くの場合、副作用や薬剤抵抗性が高いという特徴がある。

SACに影響を与える調節因子ネットワーク内の他の標的の探索も行われており、オーロラキナーゼタンパク質に高い関心が寄せられている[78]。オーロラAは増幅された場合、SACを無効化するがん遺伝子として作用し、正常でない後期の開始と異数性、そしてパクリタキセルに対する抵抗性も示す[79]。オーロラAの低分子阻害剤はin vivoモデルでの抗腫瘍効果が示されており、さらなる臨床開発の良い標的である可能性が示唆される[80]。オーロラBの阻害剤も臨床開発が行われており、異常なキネトコア-微小管間接着をもたらし、同様にチェックポイントを無効化する[78]。サバイビンも複数の経路の主要なノードとして機能するため臨床的な治療法開発の魅力的な分子標的であり、紡錘体形成とチェックポイントの制御もサバイビンが関与する経路の1つである[81]。さらに、KSPのような有糸分裂関連モータータンパク質の阻害も検討されている。近年臨床試験が開始されたこれらの阻害剤は、SACによって有糸分裂の停止を引き起こし、アポトーシスを誘導する[3][82]。